ГМИ, применяемые для производства продуктов на основе мяса и их оценка


Для соматического переноса генов могут быть использованы взрослые животные. Первые данные об экспрессии рекомбинантных генов могут быть получены непосредственно после введения генных конструкций. В то же время, существенным недостатком получения соматических трансгенных животных является невозможность передачи трансгена, а следовательно, и обусловливаемого им признака потомству. Для получения новых трансгенных животных требуется проведение повторных экспериментов.

Рассмотрим основные подходы, использующиеся в настоящее время для создания трансгенных сельскохозяйственных животных.

Метод микроинъекции

Впервые о получении трансгенных сельскохозяйственных животных сообщили две лаборатории в США и Германии. В обоих случаях для переноса генных конструкций в эмбриональные линии был использован метод микроинъекции. Этот метод и сегодня остается наиболее широко используемым для трансгенеза в животноводстве. Суть метода микроинъекции заключается во введении раствора генных конструкций в мужской пронуклеус зигот. Обычно инъецируют 1–2 пкл раствора ДНК в концентрации, соответствующей 1000 копиям в 1 пкл раствора. При этом исходят из того, что число 1000 копий/пкл приблизительно соответствует концентрации X, где Х — это длина генной конструкции в тысячах парах нуклеотидов. Например, если длина генной конструкции равна 10 т.п.н., то число 1000 копий в 1 пкл будет достигаться при концентрации равной 10 нг/мкл. Для расчета концентрации измеряют оптическую плотность раствора генной конструкции на спектрофотометре при длине волны 260 нм. 1 OD соответствует концентрации двухцепочечной ДНК равной 50 мкг/мл. При расчете молекулярной массы исходят из того, что молекулярная масса 1 п.н. равна 6,6 - 108 мг/моль.

Об успешном выполнении микроинъекции судят по увеличению объема пронуклеуса в 1,5–2 раза. В эмбрионах мышей, кроликов, овец и коз пронуклеусы достаточно хорошо визуализируются под микроскопом при увеличении без выполнения каких-либо дополнительных манипуляций. Что касается эмбрионов свиней и крупного рогатого скота, то вследствие наличия в цитоплазме темных липидосодержащих гранул определение местоположения пронуклеусов в них затруднено. Для смещения этих гранул к краям эмбриона и облегчения тем самым локализации пронуклеусов выполняют центрифугирование эмбрионов свиней и КРС при 15000 об/мин в течение 3 мин. По завершении микроинъекции эмбрионы культивируют несколько часов до момента их пересадки в яйцевод синхронизированных реципиентов. Эмбрионы КРС культивируют in vitro в течение 6–7 дней до достижения ими стадий морулы или бластоцисты и затем выполняют пересадку в матку синхронизированных реципиентов. После рождения от всех животных отбирают пробы ткани для анализа на интеграцию трансгена. Степень интеграции, то есть число трансгенных животных от общего числа родившихся животных, при использовании метода микроинъекции в зависимости от вида животных колеблется в незначительных пределах. Так, у мышей этот показатель в среднем составляет 15 %, у свиней –10–15 %, у кроликов — 10 %, у овец, коз и КРС –5–10 %.



<< В начало < Предыдущая 1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  Следующая > В конец >>